Summary
Bu makale, antioksidan aktivite ölçmek için kullanılan başlıca spektrofotometrik yöntemler hakkında bilgi vermektedir. İdeal olarak, antioksidan aktivite hem in vitro hem de in vivo yöntemlerle tayin edilmelidir. Fakat in vivo çalışmaların yüksek maliyeti nedeniyle çoğu ürün in vitro yöntemlerle değerlendirilir. Reaksiyon mekanizmalarına göre antioksidan kapasite tayinleri hidrojen transferine dayanan reaksiyonlar (HAT) ve tek elektron transferine dayanan reaksiyonlar (SET) olmak üzere iki gruba ayrılır. HAT mekanizmasına dayanan başlıca tayin yöntemleri oksijen radikal absorbsiyon kapasitesi yöntemi (ORAC), toplam radikal tuzaklayıcı antioksidan parametre yöntemi (TRAP) ve karotenoid (krosin) ağartma yöntemidir. SET mekanizmasına dayanan başlıca tayin yöntemleri Folin-Ciocalteu reaktifi (FCR) yöntemi, Troloks (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilik asit) eşdeğeri antioksidan kapasite yöntemi (TEAC), demir (III) iyonu indirgeyici antioksidan güç yöntemi (FRAP), 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikal süpürme kapasitesi yöntemi ve Cu(II)'nin oksidan olarak kullanıldığı toplam antioksidan potansiyel yöntemi (CUPRAC)'dir.Introduction
Son yıllarda yapılan çalışmalarda, özellikle reaktif oksijen ve nitrojen kaynaklı oksidatif stresin, kanser, diyabet, katarakt, romatoid artrit ve yaşlanma gibi çeşitli inflamatuvar ve dejeneratif hastalıklarda rol oynadığı kanıtlanmıştır. Canlı sistemler, çeşitli nedenlerle (UV, kimyasal oksidanlar, hava kirliliği ya da endojen etkenler) aşırı miktarlarda üretilen serbest radikaller ile bu radikallerin detoksifikasyonundan sorumlu endojen ve eksojen antioksidanlar arasında kurulu hassas bir dengeye sahiptirler. Bu dengenin oksidanlar yönünde bozulması oksidatif stres olarak tanımlanır ve bu stres birçok hastalığın etyopatogenezinde önemli rol oynar. Bu bağlamda zaman zaman endojen antioksidanların (SOD, CAT, 6Px gibi enzimatik ve melatonin, bilirubin, ürik asit gibi non-enzimatik) yetersiz kaldığı durumlarda, organizmanın eksojen antioksidanlarla desteklenmesi oksidatif stres oluşumunu önleyebilmektedir. Eksojen antioksidanlar ise çoğunlukla gıdalarla ve son yıllarda bazı preparatlarla alınabilen ve genellikle antioksidan sistemi doğrudan ya da dolaylı olarak destekleyen moleküllerdir. Bu noktada hem biyolojik materyallerdeki hem de gıdalardaki antioksidan etkili bileşenlerin miktar ve aktivite yönünden değerlendirilmesi son derece önemlidir[1]. Antioksidanlar, gıdalarda veya vücutta, yükseltgenebilen substratlara göre daha düşük konsantrasyonlarda bulunurlar ve oksidatif hasara sebep olan substratın oksidasyonunu büyük ölçüde geciktirir veya engellerler[2]. Bu nedenle yiyecek ve biyolojik sistemlerde doğal olarak oluşan moleküllerin antioksidan aktivite etkisine artan bir ilgi vardır. Antioksidan aktivite ve antioksidan kapasite terimleri birbiri yerine kullanılırlar. Fakat farklı anlamlara sahiptirler. Aktivite, spesifik bir antioksidan ve oksidan arasındaki reaksiyonun hız sabitini kapsar. Kapasite, bir numune tarafından süpürülen belirli bir serbest radikalin miktarının ölçüsüdür. Antioksidan kapasite ölçümleri, örneğin toplam süpürme kabiliyetini belirleyen, heterojen bir antioksidan karışımının miktarını verir. Her bir bileşenin antioksidan kapasitesini ölçmez[3].Farklı antioksidanlar ve oksidanlar arasındaki reaksiyonlar farklı hız sabitlerine sahiptir ve bu yüzden örneğin antioksidan kapasitesi farklı oksidanlarla değişir[4]. Ölçümde kullanılan analitik metotlar ve analizin oluştuğu koşullar da aynı gıda türü için, farklı sonuçlara neden olabilir.
Bugüne kadar pek çok farklı teknikle in vitro ve in vivo antioksidan ölçüm yöntemleri geliştirilmiştir ve uygulanmaktadır. Bu derlemede yaygın olarak kullanılan “in vitro” antioksidan ölçüm teknikleri genel bir bakış açısıyla değerlendirilecektir.
ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİN YÖNTEMLERİ
Reaksiyon mekanizmalarına göre antioksidan kapasite tayinleri
başlıca iki gruba ayrılabilir:
1. Hidrojen transferine dayanan reaksiyonlar (HAT)
2. Tek elektron transferine dayanan reaksiyonlar (SET)[5,6]
Üçüncü bir grup hem HAT hem de SET reaksiyon mekanizmalarını
içerir[6].
Hidrojen transferine dayanan reaksiyonlar
HAT mekanizmasına dayanan tayinlerin çoğu yarışmalı reksiyon
kinetiğini izler ve kantitasyon kinetik eğrilerinden yapılır.
HAT’a dayanan metotlar genellikle sentetik bir radikal
üreticiden, yükseltgenebilir moleküler probdan ve bir antioksidan
bileşikten oluşur. ORAC, TRAP gibi HAT-temelli metodlarda
peroksil radikali (ROO•) üretmek üzere bir radikal
başlatıcı kullanılır. Eklenen antioksidan radikaller için ortamdaki
substrat ile yarışır. ROO• tercihen antioksidandan bir
hidrojen atomu alır. Sonuçta ROO• ve hedef molekül arasındaki
reaksiyon inhibe edilir veya geciktirilir[5,7]
Oksijen radikal absorbsiyon kapasitesi yöntemi (ORAC)
ORAC yöntemi başlangıçta Ghiselli ve arkadaşları[8] ve
Glazer[9] tarafından çalışılmıştır. Daha sonra Cao ve arkadaşları
tarafından geliştirilmiştir[10]. ORAC peroksil radikalinin
antioksidan inhibisyonunu ölçer. Bu yöntemde peroksil radikali
floresans özellik gösteren bir molekülle (prob) floresans
olmayan bir ürün oluşturmak üzere reaksiyona girer.
R-N=N-R → N2 + 2ROO•[11]
ROO• + prob ( Floresan madde ) → ROOH + okside olmuş
prob (floresansta azalma)
ROO• + AH→ ROOH + A•
ROO• + A• → ROOA
AH: H donor (serbest radikalleri hidrojen vererek gideren antioksidan)
Antioksidanın koruyucu etkisinin hesaplanması, floresans bozunma eğrisinin altındaki integre edilmiş net alandan yapılır (AUC) (Şekil 1).
ŞEKİL 2: ORAC metodunun prensibinin şematik gösterimi[14].
[Alan antioksidan- Alan kör(antioksidan olmayan)]
ŞEKİL 3: Farklı derişimdeki Troloks standartları kullanılarak elde edilen kalibrasyon eğrisi
ŞEKİL 4: 2,2’-azobis(2-amidinopropan) dihidroklorid’i (AAPH) moleküler yapısı.
Böylece peroksil radikalleri ile oksitlenen bir hedef molekülün bir antioksidan tarafından ne kadar korunduğu, hedef molekülün bozunması floresans takibi ile izlenerek bulunur[6].
ORAC değerleri genellikle Troloks eşdeğer olarak rapor edilir. Farklı derişimdeki Troloks standartları kullanılarak kalibrasyon eğrisi elde edilir[12]. Numunenin Troloks eşdeğeri, Troloks derişimi (Y)(μM) ve floresans bozunma eğrisi altındaki net alan (Alan örnek – Alan blank) arasındaki doğrusal veya ikinci dereceden ilişki kullanılarak hesaplanır (Y=a+bX, doğrusal veya Y=a+bX +cX2, ikinci dereceden).
Orijinal ORAC yönteminde, okside olabilir protein substratı olarak floresans özellik gösteren β-fikoeritrin (B-PE) ve peroksil radikallerini üretmek için 2,2’-azobis(2-amidinopropan) dihidroklorid (AAPH) kullanılmıştır[10].
Fakat ORAC metodunda B-PE kullanımının bazı dezavantajları vardır. Bunlar şöyle sıralanabilir:
1) Porphyridium cruentum’dan izole edilen bir protein olan
B-PE peroksil radikalleriyle reaksiyonunda çok fazla değişkenlik
gösterir. Bu da sonuçlarda tutarsızlığa neden olur[13].
2) B-PE uyarma ışığına maruz kaldıktan sonra, fotokimyasal
olarak bozunur.
3) Polifenoller, özellikle proantosiyanidinler, B-PE’ye nonspesifik
olarak bağlanırlar.
Her iki durumda düşük ORAC değerlerine neden olur[5,6]. Bu problemleri çözmek için Ou, B-PE’yi floresein (FL) (3’,6’-dihidroksispiro[isobenzofuran-1[3H], 9’[9H]-ksanten]-3- on) ile yer değiştirmiştir[7]. FL sentetik protein olmayan bir probdur ve B-PE’nin limitasyonlarının üstesinden gelir. Genel olarak, numune, kontroller ve standart (bir standart eğri yapımı için dört ya da beş farklı konsantrasyonları ile Trolox) floresein çözeltisi ile karıştırılır ve AAPH çözeltisi reaksiyonu başlatmak için eklenmeden önce sabit sıcaklıkta (37 °C) inkübe edilir. Floresans şiddeti, 485 nm (uyarma)/525 nm (emisyon) dalgaboyunda her 35 dakikada çevre koşulları altında (pH 7.4, 37 °C) ölçülür. Reaksiyon ilerledikçe FL tüketilir ve floresans şiddeti azalır. Antioksidanın varlığında FL bozunması engellenir[14].
Avantajları:
ORAC testi hidrofilik ve lipofilik ekstrelerin antioksidan kapasitesini
ölçer. ORAC yöntemi kolayca otomatikleştirilir. 96
veya 48 kuyucuklu floresans mikroplaka okuyucu sistem ile
birleştirilen robotik sekiz kanallı sıvı işleme sistemi kullanılarak,
mükemmel sonuçlar elde edilmiştir[14].
Dezavantajları:
ORAC reaksiyonu sıcaklığa duyarlı bir reaksiyon olduğundan,
plaka boyunca sıcaklık kontrolü önemlidir. Küçük sıcaklık
farklılıkları tekrar üretilebilirliği azaltır. AAPH eklenmeden
önce reaksiyonun 37 °C’de inkübasyonu gün-içi değişkenliği
azaltır[15]. Uzun analiz zamanı (~1 saat) önemli bir eleştiri
olmuştur. Fakat yüksek verimlilikte testlerin geliştirilmesiyle
bu sınırlama giderilmiştir.
Toplam radikal tuzaklayıcı antioksidan parametre yöntemi
(TRAP)
Orijinal TRAP yöntemi Wayner ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir
ve çoğunlukla plazmanın antioksidan kapasitesinin
değerlendirilmesi için kullanılmıştır[16]. Bu yöntem, bir
azo bileşiğinin termal bozunmasıyla indüklenen kontrollü bir
lipid peroksidasyon reaksiyonu esnasında oksijen tüketiminin
ölçülmesi temeline dayanır. Wayner metodunda, çözünmüş
oksijen tüketimi, lipid peroksidasyon hızının bir göstergesidir
ve bundan dolayı plazmanın bu reaksiyonu engelleme kabiliyetinin
dolaylı olarak ölçülmesidir. Plazmanın oksijen tüketimi
üzerine geciktirme etkisi, bilinen miktarda troloksun geciktirme
etkisiyle karşılaştırılır. Bu metot zaman alıcı bir metotdur
(örnek başına 2 saat) ve dolayısıyla günlük çalışılacak örnek
sayısı sınırlıdır.
TRAP metodunda daha önemli bir problem, plazmanın yüksek oranda seyreltilmesinden kaynaklanır. Bu seyreltme yağ asitleri arasındaki reaksiyonun ilerlemesini zorlaştırır[17]. Bu durumda TRAP değeri seyreltmeyle orantılı olarak artar.
Reaksiyon karışımına küçük bir miktar linoleik asit eklenmesiyle problemin üstesinden gelinmiştir.
Yöntemin geliştirilmesinden birkaç yıl sonra, DeLange ve arkadaşları, antioksidan kapasiteyi ölçmek için bir dış prob kullanmayı önermişlerdir[18]. Bu metot R-fikoeritrini (R-PE) floresan prob olarak kullanmıştır. AAPH eklenmesiyle R-PE floresansı doğrusal olarak azalır. Plazma veya tek antioksidan eklenmesi, eklenen antioksidan miktarına bağlı olarak, floresansdaki azalmayı geciktirir.
R-PE ile AAPH reaksiyonunun ilerleyişi florimetrik olarak izlenir (λuyarma= 495 nm ve λemisyon= 575 nm). Bilinmeyen bir numunenin Troloks eşdeğeri olarak antioksidan kapasitesi, (X), aşağıdaki eşitlik ile ifade edilmiştir[8].
CTroloks/TTroloks=X/Tplazma
CTroloks: Troloks derişimi
TTroloks: Troloks varlığında R-PE kinetik eğrisinin gecikme
zamanı
X: Plazmanın antioksidan kapasitesi
Tplasma: Plazma varlığında kinetik eğrinin gecikme zamanı.
X daha sonra 2 ile (Troloksun stokiyometrik faktörü) ve örneğin seyreltme faktörüyle çarpılır ve TRAP değeri μmol/L olarak bulunur. TTroloks‘u numunenin aynı kinetik eğrisinden elde etmek için, R-PE floresansı başlangıç değerinin yaklaşık %50’si olunca, Troloks reaksiyon karışımına eklenir. Reaksiyon, floresans azalma hızı, Troloks eklenmeden önceki seviyeye gelinceye kadar izlenir. TTroloks ve Tplazma, Troloks eklenmesi öncesi ve sonrasında, R-PE’nin maksimum oksidasyon eğrilerinin ekstrapole edilmesiyle hesaplanır (Şekil 5).
Valkonen ve Kuusi, TRAP metodunu moleküler prob olarak diklorofloresin diasetat (DCFH-DA) uygulayarak modifiye etmişlerdir[19]. AAPH varlığında oluşan peroksil radikalleri ile DCFH-DA okside olur ve diklorofloreseine (DCF) dönüşür. DCF yüksek floresans özellik gösteren bir bileşiktir (λuyarma= 480 nm ve λemisyon= 526 nm) ve 504 nm’de absorbansa da sahiptir. Bu yüzden meydana gelen DCF ya florimetrik olarak ya da spektrofotometrik olarak izlenebilir[20].
Avantajları:
Serum veya plasma gibi biyolojik materyallerde antioksidan
kapasite ölçümleri için kullanılır, çünkü glutatyon, bilirubin,
ürik asit ve askorbik asit gibi enzimatik olmayan antioksidanların
süpürücü aktivitesini ölçer[5].
Dezavantajları:
Karışık ve zaman alıcı bir yöntemdir. Ayrıca yüksek derecede
uzmanlık ve deneyim gerektirir.
Karotenoid (Krosin) ağartma yöntemi
Karotenoidlerin otooksidasyon yoluyla renkleri açılır.
Oksidasyon ışık veya ısı yoluyla[21] veya peroksil radikalleri
ile (örneğin AAPH veya yükseltgeyici lipitler) başlatılır[22].
Bu renk açılması radikallere hidrojen atomu veren klasik antioksidanlar
tarafından önlenebilir veya azaltılabilir. Hedef olarak
β-karoten sıklıkla kullanılmasına rağmen[21], β-karotenin
470 nm’de rengini kaybetmesi, birkaç yolla olabilir. Bu yüzden
sonuçların yorumlanması zordur. Buna karşılık, ilk olarak
Bors ve arkadaşları tarafından önerilen krosinin[23], yalnızca
radikal oksidasyonu yoluyla rengi açılır. Bu nedenle β-karoten
yerine tercih edilir.
krosin - H (portakal rengi) + R00•
→ krosin•
(rengi açılmış) + R00H
krosin - H (portakal rengi) + R00•
+ AH → krosin• + R00H + A•
Ursini ve arkadaşları bu metodu plazma antioksidan kapasitesinin tayininde uygulamışlardır[24]. Deneysel olarak, reaksiyon 10 μM krosin ve bilinen miktarda antioksidan içeren 2 mL fosfat tamponu (0.1 M, pH 7.0) hazırlanmasıyla gerçekleştirilmiştir. Daha sonra reaksiyonu başlatmak için radikal başlatıcı AAPH (50 μL, 0.5 M) eklenmiştir. Renk açılması krosinin maksimum absorpsiyon yaptığı 443 nm dalgaboyunda (ε=1.33x105 M-1cm-1) 10 dakika boyunca spektrofotometrik olarak izlenmiştir. APPH eklendikten sonra krosinin ağarma hızı yaklaşık 1 dakika doğrusaldır. Antioksidanlar ağarmaya engel olur. Başlangıç krosin ağarma hızları antioksidan varlığında (V) ve yokluğundaki (V0) kinetik eğrilerden elde edilir[25]. V ve V0 arasındaki ilişki aşağıdaki eşitlikle gösterilir.
[AH] = antioksidan derişimi
[C] = krosin derişimi
kAH = ROO• ile antioksidan reaksiyonu için hız sabiti
kC = ROO• ile krosin reaksiyonu için hız sabiti
V0/V’ye karşı [AH]/[C] grafiği, eğimi kAH/kC olan ve bağıl peroksil radikal süpürme kapasitesini gösteren doğrusal bir eğri vermelidir. Plazma için, doğrusal eğri 0.79 eğimle elde edilmiştir. C vitamininin antioksidan kapasitesi 7.7 bulunmuştur. Vitamin C’nin Troloks eşdeğeri olarak hesaplanan ORAC değeri 0.95’dir[26].
Avantajları:
Krosin ağartma tekniği, mikroplakalar gibi yüksek işlem hacimli
metodolojilere kolaylıkla adapte edilebilir. Bununla birlikte
sıcaklık kontrolü kritiktir[27].
Dezavantajları:
Krosin ağartma tekniğinin, gıda örneklerinde uygulamaları
sınırlıdır. ROO• ve fitokimyasallar arasındaki reaksiyon hız
sabitleri büyük ölçüde değişebilir. Bazı fitokimyasalların reaksiyon
hızları krosine benzerdir. Bu durumda, inhibe edilmiş
ağartma hızları çok küçüktür ve metot antioksidanlardaki
konsantrasyon değişimine duyarlı değildir. Krosin 450 nm’de
absorbans yapar ve karotenoid gibi pek çok meyve pigmenti
ışığı aynı dalgaboyunda absorplar. Her bir örneğe girişimi önlemek
için, yalnızca gıda örneği ve AAPH içeren bir karışım
aynı zamanda denenmelidir[5]. Krosin safrondan ekstrakte
edilen bir doğal pigment karışımıdır ve çok çeşitlilik gösterir.
Bu yüzden partiler arası (inter-batch) farklılık fazladır. Bu
problemler metodun güvenirliğini ve kantitatif endüstriyel
uygulamalarda kullanımını kısıtlar[3].
Elektron transferine dayanan reaksiyonlar (ET)
Spektrofotometrik ET-dayanan metotlar; bir reaksiyon karışımında
iki bileşen içerir. Antioksidan ve oksidan. Oksidan antioksidandan
bir elektron alır ve bu oksidanda renk değişimine
neden olur. Renk değişiminin derecesi, antioksidan derişimiyle
orantılıdır[5].
Oksidan + e-(antioksidan) → indirgenmiş oksidan + yükseltgenmiş antioksidan
Folin-Ciocalteu yöntemi (FC)
Folin-Ciocalteu reaktifi (FCR) molibdofosfotungstik heteropoliasittir
(3 H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10 H2O). Varsayılan aktif
merkezi Mo(VI) dır.
Mo(VI)(sarı) + e-(antioksidan) → Mo(V)(mavi)
FCR, fenolik olmayan pek çok bileşik tarafından (Örneğin vitamin C, aromatik aminler, Cu(I) gibi) indirgenebileceği için, fenolik bileşiklere spesifik değildir. FC metodu gerçekte bir örneğin indirgeme kapasitesini ölçer[6]. Fenolik bileşikler FCR ile yalnız bazik koşullar altında reaksiyona girerler (Sodyum karbonat çözeltisiyle pH 10’a ayarlanır). Fenolik bir protonun ayrılması, FCR’yi indirgeme yeteneğine sahip bir fenolat anyonun oluşmasına neden olur. Fenolat ve FCR arasında oluşan mavi bileşikler, fenolik bileşiklerin yapısından bağımsızdır. Bu yüzden metal merkez ve fenolik bileşikler arasında koordinasyon bileşiği oluşma olasılığı göz ardı edilir[5].
Mavi renkli kompleks oluşumu 765 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülür. Standart olarak genellikle gallik asit kullanılır ve sonuçlar gallik asit eşdeğeri olarak (mg/L) ifade edilir.
Avantajları:
FC yöntemi ile diğer elektron transferine dayanan metotlar arasında
(örnek olarak, TEAC ve DPPH•) mükemmel doğrusal
korelasyon olduğu belirlenmiştir[27]. Magalhaes ve arkadaşları
tarafından yapılan bir çalışmada, çok sayıda içeceğin (n=72) FC
toplam indirgeyici kapasitesi TEAC metoduyla karşılaştırılmış;
kırmızı şarap, bitki ve çay infüzyonları ve bira için iyi bir korelasyon
(R>0.9) bulunmuştur[28]. FC metodu ve ORAC metoduyla
elde edilen antioksidan kapasite ölçümleri arasındaki
ilişki genellikle iyidir[6]. Bu korelasyonlar, gıda örneklerinde
antioksidan kapasitenin değerlendirilmesi için, FC toplam indirgeyici
kapasitesinin yararlılığını doğrulamaktadır.
FCR’nin tanımlanmamış kimyasal yapısına rağmen, FC yöntemi ile toplam fenol tayini güvenilir, basit ve tekrarlanabilirdir[5].
Dezavantajları:
Çok sayıda makale önerilen gallik asit referans standardı yerine
kateşin eşdeğeri[28], klorogenik asit eşdeğeri[29], kafeik
asit eşdeğeri[30], protokateşuik asit eşdeğeri[31], vanilik asit
eşdeğerini[32] kullanarak hesaplama yapmışlardır. Metotların
standardizasyon eksikliği tayin edilen fenollerde farklı değerler
elde edilmesine neden olmaktadır. Son absorbans değerleri
genellikle reaksiyona giren fenolik hidroksil gruplarının sayısıyla
orantılıdır ve molekülün yapısına bağlıdır. Eğer kalibrasyon
için kullanılan standart madde yüksek reaktiflikte ise ve
yüksek bir absorbans veriyorsa, ölçülen numune değerleri düşük
olacaktır. Örneğin, kafeik asitin (iki reaktif OH) absorbans
değeri, tek reaktif OH grubu olan bir fenolün absorbansından
iki kat daha yüksek olacaktır[33]. Şarap endüstrisinde, şarap
fenoliklerinin ölçümü için metodun standart hale getirilmesi
çabaları devam etmektedir[6].
Yöntemin zaman alması, rutin analizler için uygulanmasını zorlaştırmaktadır. Aynı zamanda sulu fazda gerçekleştirildiği için, lipofilik bileşikler için uygulanamamaktadır[34].
Troloks eşdeğeri antioksidan kapasite yöntemi (TEAC)
TEAC yöntemi ilk olarak Miller ve Rice-Evans tarafından
1993 yılında rapor edilmiştir[11]. Re ve arkadaşları bu metodu
geliştirmişlerdir[12]. Geliştirilmiş yöntemde,
2,2’-azinobis(3-etilbenzotiyazolin-6-sülfonik asit) (ABTS)’in
persülfatla oksidasyonuyla, ABTS•+ radikali oluşturulur. Bu
radikal, toplam radikal süpürme kapasitesini ölçmek için
kullanılır.
Bu metot antioksidan bileşikler tarafından ABTS’nin rengini kaybetmesi temeline dayanır. Moleküllerin kararlı serbest radikali süpürme kabiliyeti, vitamin E’nin suda çözünebilen bir analoğu olan Troloks (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman- 2-karboksilik asit) ile karşılaştırılması yapılır.
7 mM amonyum ABTS tuzu suda çözünür ve 2.45 mM potasyum persülfatla muamele edilir. Bu karışımın kullanılmadan önce oda sıcaklığında 12-16 saat beklemesi, koyu mavi renkli bir çözelti verir. Bu çözelti daha sonra, etanol veya tampon (pH 7.4) ile absorbansı 734 nm’de 0.7 olacak şekilde seyreltilir.
100 μL örnek 2.4 mL ABTS•+ çözeltisi ile karıştırılır ve 6 dakika oda sıcaklığında bekletme sonunda absorbans ölçülür[35]. Örneğin toplam radikal süpürme kapasitesi, Troloksun absorbansı azaltmasıyla ilişkili olarak hesaplanır. Sonuçlar gram örnek başına Troloks eşdeğer antioksidan kapasite cinsinden ifade edilir (TEAC/mg). Antioksidan ve oksidanlar arasındaki reaksiyon hız farklılıkları TEAC değerlerine yansımaz. Çünkü TEAC yöntemi bir bitiş noktası testidir[5].
ABTS radikalinin absorpsiyon maksimumları λmaks 415, 645, 734 ve 815 nm olarak gösterilmiştir (Şekil 7). ABTS•+ ve antioksidan arasındaki reaksiyonu izlemek için çoğu araştırmacı bunlar arasında 415 ve 734 nm’yi kullanmışlardır[37]. Özgen ve arkadaşları meyvelerde antioksidan kapasite ölçümünü ABTS metodunu modifiye ederek daha düşük pH’da yapmışlardır[38]. Sodyum asetat ile hazırlanan pH 4.5 tamponu ölçümler için kararlı bir reaksiyon ortamı sağlamıştır.
ŞEKİL 7: 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiyazolin-6-sülfonik asit) (ABTS)’nin persülfatla oksidasyonu
Avantajları:
Uygulamasının kolay olması nedeniyle, TEAC yöntemi, pek
çok araştırma laboratuvarında antioksidan kapasite çalışması
için kullanılmıştır. ABTS radikali geniş bir pH aralığında kararlıdır.
Bu yüzden antioksidan mekanizma üzerine pH etkisini
çalışmak için kullanılabilir[39]. ABTS radikali hem sulu
hem de organik çözücülerde çözünebilir ve dolayısıyla lipofilik
ve hidrofilik bileşiklerin antioksidan kapasitesini ölçmek
için kullanılabilir[40]. Radikal düşük redoks potansiyeline sahiptir
(0.68 V) ve nispeten daha düşük redoks potansiyelleri
nedeniyle fenoliklerin antioksidan kapasitesinin değerlendirilmesi
için uygundur. Çoğu fenolik bileşik bu termodinamik
özelliği nedeniyle, ABTS radikaliyle reaksiyona girebilir[40].
TEAC reaksiyonları otomatikleştirilebilir ve mikroplakalara[41], sürekli akış sistemine adapte edilebilir[42].
Dezavantajları:
TEAC reaksiyonunun bitiş noktasına ulaşması uzun bir zaman
alabilir. Böylece, kısa süreli bir bitiş noktasının kullanılması
(4-6 dakika), reaksiyon tamamlanmadan önce okuma yapılmasına ve daha düşük TEAC değerleri bulunmasıyla sonuçlanabilir[6].
Demir (III) iyonu indirgeyici antioksidan güç yöntemi (FRAP)
FRAP yönteminin avantajı elektron-transfer reaksiyonu olmasıdır.
Burada Fe(III) tuzu, Fe(III)(TPTZ)2Cl3 (TPTZ=2,4,6-
tripiridil s-triazin), oksidan olarak kullanılır[43]. Fe(III) tuzu
redoks potansiyeli (~70 V) ABTS•’nin redoks potansiyeli (0.68
V) ile benzerdir. Bu yüzden, TEAC ve FRAP yöntemleri arasında
pek fark yoktur. TEAC yöntemi, nötral pH’da, FRAP
yöntemi ise demirin çözünürlüğünü sağlamak için asidik koşullarda
(pH 3.6) gerçekleştirilir. Düşük pH değerinde, Fe(III)-
TPTZ kompleksi, Fe(II) formuna indirgenir (Şekil 7). Bu kompleks
koyu mavi renklidir ve absorpsiyon maksimumu 593
nm’dir[44].
FRAP testi aşağıdaki işlemleri içerir:
FRAP testindeki oksidan; 10 mM 40 mM HCl içinde çözünmüş 2.5 mL TPTZ, 25 mL asetat tamponu ve 20 mM 2.5 mL FeCl3. H2O’nun karıştırılmasıyla hazırlanır. Bu karışım FRAP reaktifi olarak adlandırılır. Son çözelti 1.67 mM Fe(III) ve 0.83 mM TPTZ içerir.
FRAP sonuçları, analiz zamanına bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. Hızlı reaksiyon veren polifenoller, 4 dakika gibi kısa analiz zamanlarında tayin edilirler. Bununla birlikte, bazı polifenoller daha yavaş reaksiyon verirler ve tayin için daha uzun analiz süreleri gerektirirler (30 dakikadan birkaç saate kadar). Pulido ve arkadaşları, kafeik asit, tannik asit, ferulik asit, askorbik asit ve kersetin gibi polifenoller için absorbansın 593 nm’de yavaş yavaş arttığını saptamışlardır[45].
Avantajları:
Bu yöntem hidrofilik ve lipofilik antioksidanların tayini için
uygundur. FRAP yönteminin en önemli avantajı, basitliği,
hızı, ucuzluğu ve sağlamlığıdır. Özel bir ekipman gerektirmez.
Otomatik, yarı-otomatik ve manuel metotlarla gerçekleştirilebilir[6].
Dezavantajları:
Bu reaksiyon spesifik değildir ve 0.70 V’dan daha düşük redoks
potansiyeline sahip, in vivo olarak antioksidan özellik
göstermeyen herhangi bir bileşik bile demiri indirgeyebilir[46]. Glutatyon gibi tiyol antioksidanlar FRAP yöntemiyle ölçülemezler[47]. Bunun nedeni Fe(III)’ün, kimyasal olarak inert olmasına neden olan yüksek spinli yarı dolu d orbitalleri
olabilir[48]. Ayrıca diğer bir neden FRAP yöntemi ile fizyolik
olmayan pH’da çalışılmasıdır[49]. Bu yöntem orijinal olarak
plazmanın antioksidan kapasitesini ölçmek için geliştirilmiştir,
fakat daha sonra çay ve şarabın antioksidan kapasite tayininde
kullanılmıştır[45]. FRAP sonuçları analizin zaman ölçeğine
bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir.
Karışım gıda ekstraktındaki şelatlarla bağlanabilen diğer Fe(III) türlerini içeriyorsa, potansiyel problemler meydana gelir. Bu kompleksler antioksidanlarla reaksiyona girebilir. Sonuçlar FRAP değeri ve antioksidanın verdiği elektron sayıları arasında bir ilişki olmadığını göstermiştir[3].
2,2-Difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikal süpürme kapasitesi
yöntemi
DPPH• radikali, birkaç kararlı organik azot radikalinden bir
tanesidir. Koyu menekşe renktedir. UV-GB absorpsiyon
maksimumu 515 nm’dir. Ticari olarak bulunur ve ABTS•+
radikali gibi deneyden önce hazırlanması zorunlu değildir[6]. Bu metot DPPH radikalinin antioksidanlar tarafından bir
redoks reaksiyonuna bağlı olarak süpürülmesi temeline
dayanır.
Metanolik DPPH çözeltisinin koyu menekşe rengi açılır ve absorbanstaki azalma UV-GB spektrofotometresiyle ölçülür. Alternatif olarak, antioksidan indirgeme yeteneği, elektron spin rezonans ile de değerlendirilebilir. Metanolik DPPH çözeltisindeki daha fazla renk açılması, reaksiyon karışımının absorbansında daha fazla düşme, dolayısıyla yüksek radikal süpürme kapasitesi demektir[50].
Uzun zamandan beri kullanılan renk giderme yöntemi ilk olarak Brand-Williams ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir[51]. Kalan DPPH yüzdesi, aşağıdaki şekilde hesaplanmıştır.
%DPPH• kalan =100x [DPPH• kalan]/[DPPH•]t=0
%DPPHkalan antioksidan derişimiyle doğru orantılıdır.
Başlangıç DPPH• derişiminde %50 azalmaya neden olan derişim
EC50 olarak tanımlanır. EC50 denge derişimine ulaşması
için gerekli olan zaman, kinetik eğrilerden hesaplanır ve TEC50
olarak tanımlanır. Sanchez-Moreno ve arkadaşları, antioksidan
bileşikleri, kinetik davranışına göre sınıflandırmışlardır[52].
TEC50< 5 dak (hızlı)
TEC50< 5-30 dak (orta)
TEC50< 30 dak (yavaş)
Ayrıca antioksidan kapasiteyi ifade etmek için, antiradikal verim (AE) denilen başka bir parametre tanımlamışlardır. Antiradikal verim aşağıdaki şekilde bulunur:
AE=(1/EC50)TEC50
Avantajları:
DPPH yöntemi basit ve hızlıdır. Doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar
verir[49]. Yalnızca UV-GB spektrofotometresine ihtiyaç
duyar. Çok sayıda örnek analizi mikroplaka kullanılarak
yapılabilir[53].
Dezavantajları:
DPPH yalnızca organik ortamda çözülebilir (özellikle alkol ortamında),
sulu ortamda çözünmez. Bu hidrofilik antioksidanların
rolünün yorumlanmasında önemli bir sınırlamadır[54].
Fenolik bileşiklerin ve gıdaların antioksidan kapasitesini ölçmek
ve karşılaştırmak için geniş ölçüde kullanılmaktadır, fakat
ölçümlerde ışığın etkisi göz ardı edilmemelidir. Metanol
ve aseton içindeki DPPH’ın 517 nm’deki absorbansı ışık altında,
120 dakikalık süre boyunca %20 ve %35 azalmaktadır.
Karanlıkta ise 150 dakika süre boyunca önemli bir değişme olmadığı bulunmuştur[55]. Yukarıda belirtildiği gibi çözücünün
su içeriği antioksidan kapasitesini azaltan önemli bir sınırlamadır.
Çünkü DPPH’ın bir kısmı koagüle olur ve antioksidanlarla
kolay reaksiyona giremez[34]. Bazı örnek bileşenleri,
örneğin karotenoitler, DPPH’ın 515 nm’deki absorbans
spektrumuyla çakışabilirler[56]. DPPH, canlı organizmalarda
bulunan radikallerin tersine, kararlı, uzun ömürlü bir azot radikalidir
ve yüksek reaktiflikte, kısa ömürlü, lipid peroksidasyonunda
rol alan peroksil radikallerine benzemez. Peroksil
radikalleriyle hızlı reaksiyon veren çoğu antioksidan DPPH ile
yavaş reaksiyona girebilir veya sterik engel nedeniyle DPPH’a
karşı inert olabilir. Ayrıca DPPH ile öjenol reaksiyonunun tersinir
olduğu rapor edilmiştir[5]. Bu durum öjenol ve benzer
yapıya sahip polifenolleri içeren numunenin antioksidan kapasitesinde
düşük okumalara neden olur.
DPPH radikaline sterik ulaşabilme reaksiyonun başlıca belirleyicisidir. Küçük moleküller radikale daha kolay ulaşabildiklerinden daha yüksek antioksidan kapasite değerlerine sahiptirler[5].
Cu(II)’nin oksidan olarak kullanıldığı toplam antioksidan
potansiyel yöntemi (CUPRAC)
Bu yöntem, bir numunedeki antioksidanlar tarafından
Cu(II)’nin Cu(I)’e indirgenmesi temeline dayanır. Apak ve arkadaşlarının[48] geliştirdiği bu yöntemde, 2,9-dimetil-1,10-
fenantrolin (Neokuproin veya Nc)’in Cu(II) ile oluşturduğu
bakır(II)-neokuproin kompleksinin (Cu(II)-Nc), 450 nm’de
maksimum absorbans veren bakır(I) neokuproin [Cu(I)-Nc]
kelatına indirgenme yeteneğinden yararlanarak antioksidan
kapasite hesaplanmaktadır.
Fenantrolin kompleksleri suda çok düşük çözünürlüğe sahiptirler ve %95’lik etanol gibi organik çözücülerde çözünmelidirler ve seyreltilmelidirler. Polifenoller için FRAP değerleri oldukça daha düşük iken, CUPRAC değerleri TEAC değerleriyle benzerdir.
Avantajları:
Bu reaktif seçicidir, çünkü fenantrolin veya tripiridiltriazin
türü ligandlarla bağlı demire göre daha düşük redoks potansiyeline
sahiptir. FRAP yönteminde girişime neden olan basit şekerler ve sitrik asit, CUPRAC reaktifiyle okside olmaz[48].
CUPRAC reaktifi, tiyol tipi antioksidanları okside etmek için
yeterince hızlıdır. FRAP metodu canlı bitki ve hayvan hücresinin
önemli düşük molekül ağırlıklı tiyol bileşeni olan glutatyon
gibi tiyol tipi antioksidanları ölçmez[7]. Bunun nedeni
Fe(III)’ün, kimyasal olarak inert olmasına neden olan yüksek
spinli yarı dolu d orbitalleri olabilir . Oysa Cu(II)’nin elektronik
yapısı, hızlı kinetiğe imkan verir. Sisteinin Fe(III) ile indirgenme
reaksiyonunun 1,10-fenantrolin varlığında yavaş ilerlediği
rapor edilmiştir. Fakat bu reaksiyon katalizör olarak
Cu(II) kullanılmasıyla hızlandırılmıştır[58]. CUPRAC reaktifi,
ABTS ve DPPH gibi, kromojenik radikal reaktiflerden daha
kararlıdır ve daha kolay temin edilebilir. Renkli Cu(I)-Nc şelatı
veren redoks reaksiyonu, hava, güneş ışığı, nem ve pH gibi
parametrelerden etkilenmez[48].
Dezavantajları:
CUPRAC yöntemi askorbik asit, ürik asit, gallik asit ve kersetin
için birkaç dakika içinde tamamlanır, fakat daha kompleks
moleküller için 30-60 dakika gereklidir. CUPRAC yönteminde
kompleks antioksidan karışımında uygun reaksiyon zamanını
seçme açısından problemlidir[6].
Conclusion
Başlıca spektrofotometrik antioksidan aktivite ölçüm yöntemleri hakkında bilgi verilmiştir. Farklı antioksidanlar ve oksidanlar arasındaki reaksiyonların farklı hız sabitlerine sahip olması nedeniyle örneğin antioksidan kapasitesi farklı oksidanlarla değişir. Ölçümde kullanılan analitik metotlar ve analizin oluştuğu koşullar da aynı gıda türü için, farklı sonuçlara neden olabilir.ORAC reaksiyonu sıcaklığa duyarlı bir reaksiyon olduğundan, sıcaklık kontrolü önemlidir. TRAP serum veya plazmada in vivo antioksidan kapasite ölçümleri için kullanılır, çünkü glutatyon, askorbik asit gibi enzimatik olmayan antioksidanları ölçer. Krosinin karotenoid gibi pek çok meyve pigmentinin absorpsiyon yaptığı 450 nm’de absorbans yapması ve safrandan ekstrakte edilen bir doğal pigment karışımı olması nedeniyle çok çeşitlilik göstermesi kantitatif endüstriyel uygulamalarda kullanımını kısıtlamaktadır.
FC yönteminin zaman alıcı olması rutin analizler için uygulanmasını zorlaştırmaktadır. Aynı zamanda sulu fazda gerçekleştirildiği için, lipofilik bileşikler için uygulanamamaktadır. TEAC metotlarında kullanılan ABTS radikali geniş bir pH aralığında kararlıdır. Bu yüzden antioksidan mekanizma üzerine pH etkisini çalışmak için kullanılabilir. FRAP yöntemi ile fizyolik olmayan pH’da çalışıldığından glutatyon gibi tiyol antioksidanlar bu yöntemle ölçülemezler. DPPH yalnızca organik ortamda çözülebilir (özellikle alkol ortamında), sulu ortamda çözünmez. Bu hidrofilik antioksidanların rolünün yorumlanmasında önemli bir sınırlamadır. DPPH radikaline sterik ulaşabilme reaksiyonun başlıca belirleyicisidir. Küçük moleküller radikale daha kolay ulaşacağından daha yüksek antioksidan kapasite değerlerine sahiptirler. FRAP yönteminde girişime neden olan basit şekerler ve sitrik asit, CUPRAC reaktifinin daha düşük elektrot potansiyeline sahip olması nedeniyle bu reaktifle okside olmazlar. Ayrıca CUPRAC reaktifi, tiyol tipi antioksidanları okside etmek için yeterince hızlıdır.
Antioksidan kapasite tayinlerinde doğru yöntemi seçmek çok önemlidir. Antioksidanın hidrofilik veya lipofilik olması seçeceğimiz yöntemin belirlenmesinde önemli bir kriterdir. Bu makalede antioksidan kapasite yöntemleri sınıflandırılmıştır ve bunların sınırlamaları, güçlü tarafları, avantaj ve dezavantajları açıklanmıştır.
Bu yöntemlerde kullanılan radikallerin hiçbiri, biyolojik sistemlerde bulunmaz. Bu nedenle fizyolojik olmayan radikal kaynağını gösterirler.
Reference
1) Prior RL, Cao G. Assessing antioxidant capacity in plant
foods. Free Radical Bio Med 1999; 27: S11-S.
2) Halliwell B. Antioxidant defence mechanisms:From the
beginning to the end (of the beginning). Free Radical Res
1999; 31:261-72.
3) MacDonald-Wicks LK, Wood LG, Garg ML. Methodology
for the determination of biological antioxidant capacity
in vitro: a review. J Sci Food Agr 2006; 86:2046-56.
4) Ghiselli A, Serafini M, Natella F, Scaccini C. Total antioxidant
capacity as a tool to assess redox status: Critical
view and experimental data. Free Radical Bio Med 2000;
29:1106-14.
5) Huang DJ, Ou BX, Prior RL. The chemistry behind antioxidant
capacity assays. J Agr Food Chem 2005; 53:1841-56.
6) Prior RL, Wu X, Schaich K. Standardized methods for the
determination of antioxidant capacity and phenolics in
foods and dietary supplements. J Agr Food Chem 2005;
53: 4290-302.
7) Ou B, Hampsch-Woodill M, Prior RL. Development and
validation of an improved oxygen radical absorbance capacity
assay using fluorescein as the fluorescent probe. J
Agr Food Chem 2001; 49:4619-26.
8) Ghiselli A, Serafini M, Maiani G, Azzini E, Ferroluzzi A.
A Fluorescence-Based Method for Measuring Total Plasma
Antioxidant Capability. Free Radic Bio Med 1995;
18:29-36.
9) Glazer AN. Phycoerythrin Fluorescence-Based Assay
for Reactive Oxygen Species. Method Enzymol 1990;
186:161-8.
10) Cao GH, Alessio HM, Cutler RG. Oxygen-Radical Absorbency
Capacity Assay for Antioxidants. Free Radic
Bio Med 1993; 14:303-11.
11) Niki E. Free-Radical Initiators as Source of Water-Soluble
or Lipid-Soluble Peroxyl Radicals. Method Enzymol
1990; 186:100-8.
12) Huang DJ, Ou B, Hampsch-Woodill M, Flanagan JA,
Deemer EK. Development and validation of oxygen radical
absorbance capacity assay for lipophilic antioxidants
using randomly methylated beta-cyclodextrin as the solubility
enhancer. J Agr Food Chem 2002; 50:1815-21.
13) Cao G, Prior RL. Measurement of oxygen radical absorbance
capacity in biological samples. Methods Enzymol
1999;299:50-62.
14) Huang DJ, Ou B, Hampsch-Woodill M, Flanagan JA, Prior
RL. High-throughput assay of oxygen radical absorbance
capacity (ORAC) using a multichannel liquid handling system
coupled with a microplate flourescence reader in 96-
well format. J Agr Food Chem 2002; 50:4437-44.
15) Prior RL, Hoang H, Gu LW, Wu XL, Bacchiocca M, Howard
L, Hampsch-Woodill M, Huang DJ, Ou B, Jacob R.
Assays for hydrophilic and lipophilic antioxidant capacity
(oxygen radical absorbance capacity (ORAC(FL)))
of plasma and other biological and food samples. J Agr
Food Chem 2003; 51:3273-9.
16) Wayner DD, Burton GW, Ingold KU, Locke S. Quantitative
Measurement of the Total, Peroxyl Radical-Trapping
Antioxidant Capability of Human-Blood Plasma by
Controlled Peroxidation - the Important Contribution
Made by Plasma-Proteins. Febs Lett 1985; 187:33-7.
17) Wayner DDM, Burton GW, Ingold KU, Barclay LR,
Locke SJ. The Relative Contributions of Vitamin-E,
Urate, Ascorbate and Proteins to the Total Peroxyl Radical-
Trapping Antioxidant Activity of Human-Blood
Plasma. Biochim Biophys Acta 1987; 924:408-19.
18) Delange RJ, Glazer AN. Phycoerythrin Fluorescence-
Based Assay for Peroxy-Radicals - a Screen for Biologically
Relevant Protective Agents. Anal Biochem 1989;
177:300-6.
19) Valkonen M, Kuusi T. Spectrophotometric assay for total
peroxyl radical-trapping antioxidant potential in human
serum. J Lipid Res 1997; 38:823-33.
20) Hammes E, Hoffmann A, Plieth C, Hansen UP. Light-induced
decrease in DCF fluorescence of wheat leaves in the
presence of salicyl hydroxamate. Protoplasma 2005; 227:11-5.
21) Burda S, Oleszek W. Antioxidant and antiradical activities
of flavonoids. J Agr Food Chem 2001; 49:2774-9.
22) Ursini F, Zamburlini A, Cazzolato G, Maiorino M, Bon
GB, Sevanian A. Postprandial plasma lipid hydroperoxides:
A possible link between diet and atherosclerosis.
Free Radical Bio Med 1998; 25: 250-2.
23) Huang D, Ou B, Prior RL. The chemistry behind antioxidant
capacity assays. J Agric Food Chem 2005;53:1841-56.
24) Tubaro F, Ghiselli A, Rapuzzi P, Maiorino M, Ursini F.
Analysis of plasma antioxidant capacity by competition
kinetics. Free Radical Bio Med 1998; 24:1228-34.
25) Ordoudi SA, Tsimidou MZ. Crocin bleaching assay step
by step: Observations and suggestions for an alternative
validated protocol. J Agr Food Chem 2006; 54:1663-71.
26) Bowry VW, Ingold KU. The unexpected role of vitamin
E (alpha-tocopherol) in the peroxidation of human lowdensity
lipoprotein. Accounts Chem Res 1999; 32:27-34.
27) Lussignoli S, Fraccaroli M, Andrioli G, Brocco G, Bellavite
P. A microplate-based colorimetric assay of the total
peroxyl radical trapping capability of human plasma.
Anal Biochem 1999; 269:38-44.
28) Vinson JA, Su XH, Zubik L, Bose P. Phenol antioxidant
quantity and quality in foods: Fruits. J Agr Food Chem
2001; 49:5315-21.
29) Wang MF, Simon JE, Aviles IF, He K, Zheng QY, Tadmor
Y. Analysis of antioxidative phenolic compounds in
artichoke (Cynara scolymus L.). J Agr Food Chem 2003;
51:601-8.
30) Maranz S, Wiesman Z, Garti N. Phenolic constituents
of shea (Vitellaria paradoxa) kernels. J Agr Food Chem
2003; 51:6268-73.
31) Cai R, Hettiarachchy NS, Jalaluddin A. High-performance
liquid chromatography determination of phenolic
constituents in 17 varieties of cowpeas. J Agr Food
Chem 2003; 51:1623-7.
32) Jayasinghe C, Gotoh N, Aoki T, Wada S. Phenolics composition
and antioxidant activity of sweet basil (Ocimum
basilicum L.). J Agr Food Chem 2003; 51:4442-9.
33) Stratil P, Klejdus B, Kuban V. Determination of total
content of phenolic compounds and their antioxidant
activity in vegetables - Evaluation of spectrophotometric
methods. J Agr Food Chem 2006; 54:607-16.
34) Magalhaes LM, Segundo MA, Reis S, Lima JLFC. Methodological
aspects about in vitro evaluation of antioxidant
properties. Anal Chim Acta 2008; 613:1-19.
35) Erdogan S, Ates B, Durmaz G, Yilmaz I, Seckin T. Pressurized
liquid extraction of phenolic compounds from
Anatolia propolis and their radical scavenging capacities.
Food Chem Toxicol 2011; 49:1592-7.
36) Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang
M, Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved
ABTS radical cation decolorization assay. Free
Radical Bio Med 1999; 26:1231-7.
37) Cano A, Acosta M, Arnao MB. A method to measure antioxidant
activity in organic media: application to lipophilic
vitamins. Redox Rep 2000; 5:365-70.
38) Ozgen M, Reese RN, Tulio AZ, Scheerens JC, Miller AR.
Modified 2,2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic
acid (ABTS) method to measure antioxidant capacity
of selected small fruits and comparison to ferric reducing
antioxidant power (FRAP) and 2,2 ‘-diphenyl-1-picrylhydrazyl
(DPPH) methods. J Agr Food Chem 2006;
54:1151-7.
39) Lemanska K, Szymusiak H, Tyrakowska B, Zielinski R,
Soffers AEMF, Rietjens IMCM. The influence of pH on
antioxidant properties and the mechanism of antioxidant
action of hydroxyflavones. Free Radical Bio Med
2001; 31:869-81.
40) Osman AM, Wong KKY, Hill SJ, Fernyhough A. Isolation
and the characterization of the degradation products
of the mediator ABTS-derived radicals formed upon
reaction with polyphenols. Biochem Bioph Res Co 2006;
340:597-603.
41) Erel O. A novel automated method to measure total antioxidant
response against potent free radical reactions.
Clin Biochem 2004; 37:112-9.
42) Buratti S, Pellegrini N, Brenna OV, Mannino S. Rapid
electrochemical method for the evaluation of the antioxidant
power of some lipophilic food extracts. J Agr Food
Chem 2001; 49:5136-41.
43) Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma
(FRAP) as a measure of ‘’antioxidant power’’: The FRAP
assay. Anal Biochem 1996; 239:70-6.
44) Benzie IF. An automated, specific, spectrophotometric
method for measuring ascorbic acid in plasma (EFTSA).
Clin Biochem 1996; 29:111-6.
45) Pulido R, Bravo L, Saura-Calixto F. Antioxidant activity
of dietary polyphenols as determined by a modified ferric
reducing/antioxidant power assay. J Agr Food Chem
2000; 48:3396-402.
46) Nilsson J, Pillai D, Onning G, Persson C, Nilsson A,
Akesson B. Comparison of the 2,2’-azinobis-3-ethylbenzotiazoline-
6-sulfonic acid (ABTS) and ferric reducing
antioxidant power (FRAP) methods to asses the total antioxidant
capacity in extracts of fruit and vegetables. Mol
Nutr Food Res 2005; 49:239-46.
47) Ou BX, Huang DJ, Hampsch-Woodill M, Flanagan JA,
Deemer EK. Analysis of antioxidant activities of common
vegetables employing oxygen radical absorbance
capacity (ORAC) and ferric reducing antioxidant power
(FRAP) assays: A comparative study. J Agr Food Chem
2002; 50:3122-8.
48) Apak R, Guclu K, Ozyurek M, Karademir SE. Novel total
antioxidant capacity index for dietary polyphenols and
vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability
in the presence of neocuproine: CUPRAC method.
J Agr Food Chem 2004; 52:7970-81.
49) Perez-Jimenez J, Arranz S, Tabernero M, Diaz-Rubio ME,
Serrano J, Goni I, Saura-Calixto F. Updated methodology
to determine antioxidant capacity in plant foods, oils
and beverages: Extraction, measurement and expression
of results. Food Res Int 2008; 41:274-85.
50) Ndhlala AR, Moyo M, Van Staden J. Natural Antioxidants:
Fascinating or Mythical Biomolecules? Molecules
2010; 15:6905-30.
51) Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C. Use of a Free-
Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity. Food
Sci Technol-Leb 1995; 28:25-30.
52) Sanchez-Moreno C, Larrauri JA, Saura-Calixto F. A procedure
to measure the antiradical efficiency of polyphenols.
J Sci Food Agr 1998; 76:270-6.
53) Fukumoto LR, Mazza G. Assessing antioxidant and
prooxidant activities of phenolic compounds. J Agr Food
Chem 2000; 48:3597-604.
54) Arnao MB. Some methodological problems in the determination
of antioxidant activity using chromogen radicals:
a practical case. Trends Food Sci Tech 2000; 11:419-21.
55) Ozcelik B, Lee JH, Min DB. Effects of light, oxygen, and
pH on the absorbance of 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl.
J Food Sci 2003; 68:487-90.
56) Nomura T, Kikuchi M, Kubodera A, Kawakami Y. Proton-
donative antioxidant activity of fucoxanthin with
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Biochem Mol
Biol Int 1997; 42:361-70.