Journal of Research in Pharmacy

Summary

Kesilmiş sütün sıvı kısmı olan süt serumu (whey) sütün tedavi edici etkilerinden sorumlu tutulmaktadır. Peynir yapımı sırasında sütten ayrılan ve süt serumu veya ‘peynir altı suyu' olarak da adlandırılan sıvının süt serumu proteinlerince zengin olduğu bilinmektedir. Bu yan ürün gıda endüstrisinde toz haline getirilerek kullanılmakta ve peynir altı suyu tozu (PAST) olarak adlandırılmaktadır. Çalışmalarımızda iki farklı yöntemle elde edilmiş süt serumu örnekleri kullanıldı. Birincisi günlük, taze ve pastörize edilmemiş inek sütünden elde edilen süt serumu, diğeri ise peynir yapımı sırasında elde edilen ve liyofilize edilerek endüstriyel bir gıda ürünü olarak satılan peynir altı suyu tozu (PAST) idi. Çalışmamızda bu ürünlerin, bakır ile oksidasyonu indüklenmiş insan serumunda lipit peroksidasyonuna ve protein oksidasyonuna olan etkisinin karşılaştırılması amaçlandı. Deneylerimizde; süt serumu proteinlerinde total ve serbest –SH grubu ölçümü, serumda lipit peroksidasyonu ölçümü (TBARS ve Dien Konjugasyon yöntemleriyle) ve serumda protein oksidasyonu ölçümü (protein karbonilleri) yöntemleri kullanıldı. Bu örneklerin protein miktarları Bradford yöntemi ile belirlendi. Sonuç olarak, PAST ve çiğ süt serumunun okside serum üzerine direk antioksidan etkisi olduğu ve bu etkinin içerdikleri –SH grubu miktarı ile ilişkili olduğu saptandı. –SH miktarı daha yüksek olan PAST'ın çiğ süt serumundan daha güçlü antioksidan etkiye sahip olduğu görüldü.

Summary

Introduction

Beslenmenin genel sağlık durumuna etkisini, özellikle de bazı gıdaların tedavi edici etkilerini aydınlatabilmek için son yıllarda giderek artan sayıda araştırma yapılmaktadır. Süt, hastalık tedavi edici nitelik taşıdığı düşünülen gıdalar arasında öne çıkmakta ve özellikle sütün ‘süt serumu’ fraksiyonunun bu etkinin asıl sorumlusu olduğu öne sürülmektedir. Süt serumu β-laktoglobulin, α-laktalbumin, serum albumin, ve immunoglobulinlerden oluşan bir protein karışımıdır. Çok sayıda çalışmada süt serumunun çok yönlü terapötik etkileri aydınlatılmış ve bu protein karışımının antikanserojen ve serbest radikal hasarını önleyen etkileri öne çıkmıştır[1,2].

Süt serumu, kazeini içeriği çöktürülmüş sütün sıvı kısmı olarak tanımlanabilmekle beraber, aslında peynir yapımı sırasında elde edilen bir yan üründür[3]. İngilizce terminolojide ‘whey’ olarak adlandırılan bu ürünün dilimizdeki karşılığı ‘süt serumu’ veya ‘peynir altı suyu’dur. Peynir altı suyunun liyofilize edilerek toz haline getirilmiş şekli (peynir altı suyu tozu-PAST) gıda endüstrisinde kullanılmaktadır.

Serbest radikaller hücre ve dokularda bir çok zarara yol açarak, akut ve kronik hastalıkların etiyolojisinde önemli bir rol oynarlar. Bu nedenle hastalık tedavisi için organizmanın kendi antioksidan kapasitesini güçlendirecek çözümler bulmak günümüzde çok sayıda bilimsel araştırmanın ana hedefidir. Süt serumu proteinlerinin antikanserojen ve bağışıklığı destekleyen etkileri çok sayıda in vivo araştırmada bildirilmiştir. Bu bulgular nedeniyle süt serumu proteinlerinin hastalık tedavisini destekleyen etkileri, organizmadaki antioksidan kapasiteyi bir yolla arttırmasıyla açıklanmaya çalışılmıştır. En çok üzerinde düşünce birliği olan hipotez, süt serumu proteinlerinin organizmada glutatyon (GSH) düzeyini arttırarak antioksidan etki gösterdiği düşüncesidir[2,4,5]. Aynı hipotez üzerinde planlanan in vitro çalışmalarda ise süt serumu proteinlerinin çeşitli yağ emülsiyonlarında lipit peroksidasyonunu gerilettiği gösterilmiştir[6,7].

Çalışmamızda süt serumu proteinlerinin antioksidan etkilerini in vitro koşullardaki bulgularımızla aydınlatmayı hedefledik. Endüstriyel bir yan ürün olan PAST ile taze çiğ sütten elde ettiğimiz süt serumu örneklerinin in vitro etkilerini de birbirleriyle karşılaştırdık. PAST ve çiğ süt serumu örneklerinin serbest sülfidril (-SH) gruplarının miktarlarını belirledikten sonra ısıtılmış örneklerde –SH miktarında bir değişim olup olmadığını araştırdık. Aynı örneklerin sağlıklı insan serumunda bakır ile uyarılan lipit peroksidasyonunu ve protein oksidasyonunu ne yönde etkilediğini ve ısıtma işleminin örneklerdeki antioksidan etkinliği ne şekilde değiştireceğini araştırmayı hedefledik.

Introduction

Methods

Çalışmalarımızda iki farklı yöntemle elde edilmiş süt serumu örnekleri kullanıldı. Birincisi günlük, taze ve pastörize edilmemiş inek sütünden elde edilen süt serumu, diğeri ise peynir yapımı sırasında elde edilen ve liyofilize edilerek endüstriyel bir gıda ürünü olarak satılan peynir altı suyu tozu (PAST) idi.

Süt serumu proteinlerinin çiğ inek sütünden eldesi
Çalışmamızda, çiğ inek sütünden öncelikle kazein fraksiyonu asitle çöktürüldü ve sonra diyaliz uygulanarak süt serumu elde edildi. Protein saflaştırmasında uygulanan bir yöntem olan diyaliz yönteminde, protein çözeltisi yarı-geçirgen bir membran torba içine doldurulur. Bu membran uygun derişimde bir tampon içine yerleştirildikten sonra, küçük moleküller membrandan geçerek tampon ortamına karışırken, membrandan geçemeyen büyük moleküller torba içinde yoğunlaşırlar. Elde edilen süt serumu –20 °C’de korundu[8].

PAST’daki süt serumu proteinlerinin çözelti haline getirilmesi
Kazein dışındaki süt proteinlerini içeren peyniraltı suyu peynir yapımı sırasında yan ürün ve atık olarak oluşmaktadır. Bahçıvan Gıda Sanayi ve Ticaret A. Ş.’den temin edilen PAST’dan PBS (pH 7.4) ile % 5 ’lik, % 10’luk ve %20’lik çözeltiler hazırlandı. Ön denemelerden sonra, deneylerimiz için uygun konsantrasyonun % 5 olduğuna karar verildi.

PAST çözeltisi ve çiğ süt serumunun artan sıcaklıklarda ısıtılması
Süt serumu proteinlerinin artan sıcaklıklarda ısıtılmasının, antioksidan özellikleri üzerine etkisini aydınlatabilmek için, deneylerimizde çiğ süt serumu ile % 5’lik PAST çözeltisi örnekleri 15’er dakika süre ile 50, 60, 70 ve 80°C sıcaklıktaki su banyosunda ısıtıldı. Sonraki deneylerde bu örnekler de kullanıldı.

Bradford yöntemi ile protein tayini
Süt serumu örneklerimizdeki protein tayini, Bradford yöntemi ile yapıldı. Oldukça duyarlı olan bu yöntem (5-100 mg/ml); organik boyaların, proteinlerin asidik ve bazik grupları ile etkileşerek, renk oluşturmasını esas alır. Sonuç hesaplaması, sığır serum albumini ile hazırlanan standart eğrisinden yararlanılarak yapıldı[9].

Protein sülfidril (–SH) gruplarının tayini
Örneklerimizdeki serbest ve total –SH grupu tayini, Ellman metodunun bir modifikasyonu ile gerçekleştirildi. Ekstinksiyon katsayısı (e=13.600 M.L^-1.cm^-1 ) kullanılarak hesaplandı, sonuçlar mmol/L olarak ifade edildi[10,11].

Süt serumu proteinlerinin, CuSO₄ ile indüklenen serum lipit peroksidasyonuna etkisinin TBARS yöntemi ile ölçümü
Cu⁺²’ın plazma lipoproteinleri için bir oksidan olmasından yararlanılarak CuSO₄ ile okside edilmiş serum veya plazma örneğinde TBARS değerinin süt serumlarının varlığında değişimini spektrofotometrik olarak 535 nm’de incelendi. Sağlıklı taze insan serumu, PAST’nun 0.5 M PBS (pH 7.4) içinde hazırlanmış % 5’lik çözeltisi, çiğ süt serumu ve her iki örneğin 50, 60, 70, ve 80°C’de ısıtılmış örnekleri taze olarak kullanıldı[12,13].

Süt serumu proteinlerinin serumda dien konjugasyona etkisi
Lipit hidroperoksitlerindeki konjuge dien yapılarının 234 nm’deki absorbanslarının zamana karşı ölçümü, lipoprotein oksidasyonunun karakterize edebilen kullanışlı bir yöntemdir. Deneylerimizde taze sağlıklı insan serumu, 0,5 M PBS (pH=7.4) ile % 0.67 oranında sulandırılarak dien konjugasyon ölçümleri yapıldı[14,15].

Süt serumu proteinlerinin protein oksidasyonuna etkisi
Süt serumu proteinlerinin antioksidan etkilerini daha geniş çerçevede değerlendirebilmek için bu proteinlerin serumdaki protein oksidasyonuna olan etkisi de araştırıldı. % 5’lik PAST çözeltisi ve çiğ süt serumu örnekleri ve taze insan serumu 1/10 oranında sulandırılarak kullanıldı[16,17].

Methods

Results

Çiğ süt serumu ve % 5’lik PAST çözeltisinin protein, serbest ve total –SH ölçümleri yapıldı. % 5’lik PAST .çözeltisinin protein miktarı 95 g/l, çiğ süt serumunun ise 227.2 g/l olarak belirlendi . Çiğ süt serumununun % 5’lik PAST çözeltisinden daha fazla miktarda protein içermesine karşın, gram protein başına daha az –SH grubu içerdiği görüldü. Total –SH ölçümleri sonucunda % 5’lik PAST çözeltisinde 0.7 mmol/g. protein, çiğ süt serumunda ise 0.57 mmol/g. protein –SH bulunduğu belirlendi. Ayrıca 50, 60, 70 ve 80°C sıcaklıklarda ısıtılmış örneklerin serbest –SH ölçümleri yapıldı. Isıtma işleminin örneklerdeki serbest–SH miktarını arttırdığı görüldü (Tablo 1).

TABLO 1: %5 PAST ve Çiğ Süt Serumu örneklerinin ısıtma sonucunda serbest -SH miktarlarındaki değişim (mmol/l.gr protein)

% 5’lik PAST çözeltisinin ve ısıtılan örneklerinin okside serumda lipit peroksidasyonuna ve protein oksidasyonuna etkisi
CuSO₄ ile okside edilen serumda %5’lik PAST çözeltisinin lipit peroksidasyonu ve protein oksidasyonunu kontrole göre belirgin biçimde gerilettiği görüldü. PAST örneklerimizin serumda lipit peroksidasyonuna olan etkisi hem TBARS hem de dien konjugasyon oluşumunun baskılanması ile belirgin şekilde saptanırken, ısıtılmamış (25°C), 50 ve 60°C ısıtılmış örneklerin etkilerinin birbirlerine oldukça yakın olduğu gözlendi. 70 ve 80°C’de ısıtılan örneklerin, lipit peroksidasyonuna olan etkisinin serbest –SH değişimine benzer biçimde arttığı saptandı. Üç saat süresince yapılan lipit peroksidasyon ölçümlerinde PAST örneklerinin antioksidan etkisi 120. dakika itibariyle daha da belirginleşti. PAST örneklerinin serum lipit peroksidasyon (TBARS) ve dien konjugasyon olan etkisi Şekil 2 ve Şekil 3’de grafiklerle gösterilmiştir.

ŞEKİL 1: Bakır ile serum oksidasyonunun genel uygulama diyagramı

ŞEKİL 2: %5’lik PAST çözeltisinin ve ısıtılan örneklerinin okside serumda lipit peroksidasyonuna (TBARS) etkisi

ŞEKİL 3: %5’lik PAST çözeltisinin ve ısıtılan örneklerinin okside serumda dien konjugasyonuna etkisi

PAST örneklerinin okside serumda protein oksidasyonuna olan etkisi incelendiğinde, PAST örneklerinin serum protein oksidasyonunu baskıladığı, 70 ve 80°C ısıtılan örneklerde bu etkinin en yüksek düzeyde olduğu belirlendi. Şekil 4’de PAST örneklerinin serum protein oksidasyonuna olan etkisi grafikle gösterilmiştir. Tüm örneklere ait ölçümler 4 kez tekrarlanıp, hesaplanan ortalama değerlerle grafikler oluşturulmuştur.

ŞEKİL 4: %5’lik PAST çözeltisinin ve ısıtılan örneklerinin okside serumda protein oksidasyonuna etkisi

Çiğ süt serumunun ve ısıtılan örneklerinin okside serumda lipit peroksidasyonuna ve protein oksidasyonuna etkisi
CuSO₄ ile okside edilen serumda çiğ süt serumunun serum lipit peroksidasyonu ve protein oksidasyonunu kontrole göre belirgin biçimde baskıladığı görüldü. Isıtılan örneklerde uygulanan sıcaklık arttıkça (70 ve 80°C’de en belirgin şekilde), lipit peroksidasyonuna olan etkinin serbest –SH değişimine benzer biçimde arttığı saptandı. Serum protein oksidasyonuna olan etki sıcaklık artışı ve –SH artışına çok fazla paralel olmamakla birlikte 70 ve 80°C ısıtılmış örneklerde 180. dakikada en yüksek düzeyde saptandı. Çiğ süt serumunun lipit peroksidasyonunu ve protein oksidasyonunu baskılayan etkisinin, % 5’lik PAST çözeltisine kıyasla daha az olduğu görüldü. Şekil 5 ve Şekil 6’da çiğ süt serumu örneklerinin serum lipit peroksidasyon ve dien konjugasyonuna etkisi, Şekil 7 ’de ise serum protein oksidasyonuna etkisi grafiklerle gösterilmiştir. Tüm örneklere ait ölçümler 4 kez tekrarlanıp, hesaplanan ortalama değerlerle grafikler oluşturulmuştur.

ŞEKİL 5: Çiğ süt serumunun ve ısıtılan örneklerinin okside serumda lipit peroksidasyonuna (TBARS) etkisi

ŞEKİL 6: Çiğ süt serumunun ve ısıtılan örneklerinin okside serumda dien konjugasyon oluşumuna etkisi

ŞEKİL 7: Çiğ süt serumunun ve ısıtılan örneklerinin okside serumda protein oksidasyonuna etkisi

Results